Wnt-Antagonisten

Die Bedeutung des Wnt-Pathways in humanen Tumoren

Bereits 1987 konnten Roel Nusse und Mitarbeiter zeigen, dass das Drosophila Segment-Polaritätsgen wingless und das mit Brustkrebs-Entstehung bei Säugern assoziierte Gen int-1 identische (orthologe) Gene sind (Rijsewijk et al. Abstract*). Aus wingless und int-1 entstand dann der heute geläufige Name "Wnt-Gene" für Mitglieder dieser Genfamilie in Säugern (Nusse R et al. (1991) Cell 64: 231).
WNT-Proteine sind sezernierte Glykoproteine die membran-assoziiert verbleiben und Signal-Übertragung über kurze Distanzen ermöglichen. Die Rezeptoren der WNT-Moleküle sind 7-Transmembran-Proteine, von denen es im humanen System zehn Mitglieder (Frizzled 1-10) gibt (http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html*).
Das zentrale Molekül im kanonischen WNT-Signalweg ist das intrazelluläre ß-Catenin,dessen Anhäufung im Kern von Mammakarzinomzellen als Maß für einen pathologisch aktivierten WNT-Signalweg betrachtet wird (Lin et al. Abstract*). Der WNT-Signalweg wird durch eine Reihe von negativen Regulatoren präzise reguliert, von denen die sog. "Secreted Frizzled Related Proteins" (SFRPs) (Suzuki et al. Abstract*) die bekanntesten WNT-Antagonisten darstellen. Hierbei handelt es sich um
sezernierte Rezeptoren, die WNT-Moleküle mittels ihrer CRD-Domäne binden, aber nicht zur Aktivierung des Signalwegs führen.

Wir konnten kürzlich zeigen, dass das normale Drüsenepithel der Mamma größere Mengen des WNT-Inhibitors SFRP1 exprimiert, die Expression von SFRP1 aber in ca. 70% aller Mammakarzinome stark reduziert vorliegt oder vollständig verloren ist (Klopocki et al. Abstract*).
Daraus ergibt sich für die pathologische Aktivierung des WNT-Signalwegs während der Entstehung von Mammakarzinomen das in der obigen Abbildung dargestellte Modell.

Abbildung A: Im Mamma-Normalgewebe verhindern hohe SFRP1-Konzentrationen eine Aktivierung des WNT-Signalwegs. Ein Proliferationssignal unterbleibt. Der präzise Zeitpunkt des SFRP1-Verlusts in der Tumorgenese des Mammakarzinoms ist noch unbekannt; dieser tritt jedoch früh auf, noch vor dem Stadium
des duktalen carcinoma in situ (DCIS). Nach unserem Modell liegt im DCIS und im invasiven Mammakarzinom dann die in Abbildung B dargestellte Situation vor: Der Verlust der SFRP1 Expression führt zur pathologischen Aktivierung des WNT-Signalwegs und zur Expression proliferationsfördernder Gene.

Wir konnten kürzlich zeigen, dass Promoter-Methylierung der vorherrschende Mechanismus der SFRP1-Inaktivierung im Mammakarzinom darstellt. (Veeck et al. Abstract*). Für eine Rolle des SFRP1 als Tumorsuppressorgen in der frühen Brustkrebsentwicklung spricht weiterhin, dass die Promoter-Methylierung des SFRP1-Gens signifikant mit einem verschlechterten Gesamtüberleben der betroffenen Patientinnen korreliert (Veeck et al. Abstract*). Die Analyse der Promoter-Methylierung des SFRP1 Gens eröffnet daher möglicherweise neue Möglichkeiten in der Früherkennung bzw. der Therapiebegleitung von Patientinnen mit Brustkrebs.

SFRP1-Projekt

SFRP1 ist ein wichtiges Molekül des WNT-Pathways. Wir haben als erste Arbeitsgruppe einen SFRP1-spezifischen Antikörper charakterisiert und damit gezeigt, dass SFRP1 Protein in mehr als 80% aller Mammakarzinome komplett oder fast vollständig verloren geht (Klopocki et al.: Abstract*).
Dabei zeigte sich, daß der Verlust von SFRP1 schon früh in der Tumorgenese des Mammakarzinoms auftritt; so weist das Gewebe von Patientinnen mit duktalen carcinoma in situ (DCIS) bereits ähnlich hohe Verlustraten für SFRP1 auf wie beim invasiv duktalen Mammakarzinom (IDC).
Tatsächlich scheint SFRP1 in den frühen Mammakarzinomen (pT1-Tumore, d.h. bis 2 cm Durchmesser) noch eine protektive Wirkung zu haben. Unter 310 Patientinnen mit pT1 Tumoren hatten jene mit persistierender SFRP1 Expression eine deutlich bessere Prognose als solche Patientinnen mit einem
Verlust des SFRP1 (Klopocki et al.: Abstract*).

Die molekulare Ursache für den Verlust des SFRP1-Proteins in vielen Mammakarzinomen konnte von unserer Arbeitsgruppe erfolgreich entschlüsselt werden. So kommt es im Laufe der Tumorentstehung häufig zu einer aberranten Methylierung von Cytosinresten im Promotor von Tumorsuppressorgenen. Diese Promoter-Methylierung führt dazu, dass das Gen nicht mehr transkribiert werden kann ("Silencing"). Eine stabile epigenetische Veränderung des SFRP1-Promoters war in den Tumorgeben von 61% aller untersuchten Brustkrebs-Patientinnen (n=130) zu finden und war nachweislich für den Transkriptionsverlust von SFRP1 verantwortlich. Darüber hinaus wurden keine
Gen-inaktivierenden Mutationen gefunden, sodass aberrante SFRP1-Promotormethylierung offensichtlich den fundamentalen molekularen Mechanismus des SFRP1-Silencing im Mammakarzinom darstellt.
Interessanterweise war die Promotor-Methylierung signifikant mit einem verkürzten Gesamt-Überleben der Patientinnen assoziiert, was das SFRP1-Molekül
als einen potentiell wertvollen, prognostischen Biomarker des Mammakarzinoms klassifiziert (Veeck et al.: Abstract*).
Die Validierung der SFRP1-Promotormethylierung als neuer Biomarker des humanen Brustkrebses wird zur Zeit an einem großen Patientenkollektiv durchgeführt.

Weiterhin haben wir begonnen die biologische Funktion des SFRP1-Moleküls in Zellkulturexperimenten zu erforschen. In transient transfizierten MCF7- und SKBR3-Mammakarzinomzellen fanden wir biologische Effekte von SFRP1 sowohl auf die Zellproliferation und die Invasion (erniedrigt) als auch auf die Zelladhäsion (erhöht). Parallel dazu wurde in einer benignen, SFRP1 exprimierenden Brust-Zelllinie die Expression des Gens mittels RNA-Interferenz Technologie (RNAi) erfolgreich ausgeschaltet, und wir haben nun begonnen, die phänotypischen Auswirkungen dieses Expressionsverlusts genauer zu charakterisieren.