AG Inga Weßels: Zink und Entzündung im angeborenen Immunsystem

Beteiligte Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter:

Dr. rer. nat Inga Weßels
Gabi Engelhardt (MTA)
cand. med. Isabell Aster
cand. med. Lisa-Marie Barth
cand. med. Yifan Peng-Winkler
cand. med. Marijke van der Laan
M. Sc. Asad Shahzad
M. Sc. Nora Tillmann
B. Sc. Gabriel Crespo
B. Sc. Nora Schniedermann

Thematik 

 

Seit der Entdeckung von Zinkdefizienz in den 60er Jahren, wurde die Bedeutung von Zink für die Gesundheit des Menschen tiefgehend erforscht. Auch wenn die 2 – 3g Zink, die im Körper zu finden sind gering erscheinen, führt Zinkmangel zu starken Symptomen; hierzu gehören Wachstumsstörungen, neuropsychologische Störungen, Thymusatrophie, Hauterkrankungen, Unfruchtbarkeit und erhöhte Anfälligkeit für Infektionen. Insbesondere die Funktionalität des Immunsystems hängt enorm von der Verfügbarkeit von Zink ab. Trotz enormer Fortschritte und der Charakterisierung einer Großzahl zinkabhängiger Prozesse, bleiben jedoch noch viele Fragen offen. Bezüglich des adaptiven Immunsystems gibt es eine große Zahl an Forschungsergebnissen aus Studien an Mensch und Tier. Obwohl die Zellen des angeborenen Immunsystems die ersten sind, die im Falle einer Infektion den Erreger bekämpfen, liegen hier weniger Daten vor. Studien an Mäusen weisen jedoch darauf hin, dass es unter Zinkmangel zu einer Priorisierung des angeborenen Immunsystems auf Kosten des adaptiven Immunsystems kommt. Diesen Hinweisen geht die Arbeitsgruppe „Zink und Entzündungserkrankungen: angeborene Immunzellen aus dem Gleichgewicht“ nach.

Projekte

Zink und Granulopoese

Während die Rolle von Zink im adaptiven Immunsystem recht gut erforscht ist, wissen wir weniger über den Effekt von Veränderungen in der Zinkhomeostase auf Zellen des angeborenen Immunsystems. Hierzu zählen unter anderem Monozyten und Makrophagen sowie Neutrophile, Basophile und Eosinophile Granulozyten. Sie sind die ersten, die bei einer Infektion den Pathogenen begegnen und sie bekämpfen. Es scheint, als würde es unter Zinkmangelbedingungen zur Priorisierung des angeborenen Immunsystems kommen, erkennbar am Anstieg der Anzahl und teilweise auch der Funktionalität dieser Zellen. Diese These gilt es jedoch noch zu beweisen.

Arbeiten aus dem Institut zeigen, dass die Entwicklung der Monozyten mit einer Erniedrigung des intrazellulären Zinklevels einhergeht. Unter Zinkmangel wird die Entwicklung monozytärer Zellen aus ihren Vorläufern verstärkt. Daten zur Rolle der Zinkhomeostase während der Granulopoese liegen derzeit jedoch nicht vor, so dass dieses Thema einen der Projektschwerpunkte darstellt. Zinkhomeostase und ihre Regulation sollen charakterisiert werden. Erste Versuchsergebnisse deuten auf die Beteiligung von Zink an der Regulation der Granulopoese hin. Untersuchungen sollen sich jedoch nicht nur auf die Entwicklung der Granulozyten beschränken, sondern auch den Effekt von Zinkmangel und Zinksupplementation auf ihre Funktionalität ergründen. Auch hier zeigen erste Experimente eine Rolle von Zink bei der Genregulation. Die Bedeutung von Zink bei epigenetischen Prozessen wurde in einer früheren Studie gezeigt, so dass auch dieser Punkt im Zusammenhang mit Reifung und Aktivität der Granulozyten beleuchtet werden sollen.

Erkrankungen, die auf Fehlfunktionen und Mangel von Granulozyten beruhen, wie beispielsweise die septische Granulomatose oder Defekte bei der Abtötung von Pathogenen, weisen schwerwiegende Symptome auf. Die Auswahl an therapeutischen Möglichkeiten ist zurzeit gering und beinhaltet oft lange Behandlungszeiträume. Ein besseres Verständnis der Granulozytenentwicklung und –funktion und der Effekt von Zinkmangel oder -supplementation kann die Basis zur Entwicklung neuer und die Verbesserung vorhandener Therapieansätze bilden.

Zinkmessung mittels FRET-basierter, genetisch kodierter Sonden

Die Rolle von Zink in biologischen Systemen wurde in den letzten Jahren intensiv erforscht. So wurde beispielsweise die Wichtigkeit von Zink bei der Regulation des intrazellulären Signallings beschrieben. Hierbei spielen sowohl die Rolle von Zink als Co- und struktureller Faktor, als auch seine Wirkung als Second Messenger eine entscheidende Rolle. Trotz großen Fortschritten auf diesem Gebiet, gibt es jedoch noch viele offene Fragen. Ein großes Problem stellt in diesem Zusammenhang die Charakterisierung der intrazellulären Zinkhomeostase dar. Häufig werden Sonden eingesetzt, die teils unspezifisch auch andere zweiwertige Ionen binden, schwache Bindungen aufweisen und schnell ausbleichen. Auch akkumulieren sie zelltypspezifisch oft in bestimmten Kompartimenten und verfälschen so das Ergebnis. Alternativ gibt es seit einigen Jahren genetisch kodierte, FRET-basierte Sonden, die sogar Kompartiment- bzw. Organell-spezifisch exprimiert werden können. Bisherige Arbeit mit diesen FRET-basierten Sonden bedient sich meist kurzfristiger Transfektion von Zellen und der Betrachtung einzelner Zellen unter dem Mikroskop. Der Einfluss der Sonde auf den Zellstoffwechsel ist noch nicht eindeutig erörtert.

Das Projekt des Institutes für Immunologie beschäftigt sich derzeit mit der Etablierung des Systems für stabile Transfektionen, Dauerkulturen und Langzeitmessungen. Da der Einsatz der Sonden bisher nur für wenige Zelllinien beschrieben ist, soll die Liste erweitert werden. Die Transfektion primärer Zellen für Kurzzeitmessungen ist angedacht. Auch soll der Einsatz diese Systems für Messungen am Durchflusszytometer und zur Aufnahme von Messkinetiken an Plattenlesegeräte optimiert werden. Dies soll sowohl für zytosolische als auch für organellspezifische Messungen erfolgen. Ziel ist es den Weg des Zinkes in die Zelle hinein und seine Verteilung innerhalb der Zelle zu beschreiben und mit unserem derzeitigen Wissen der Rolle von Zink im intrazellulären Signalling zu verknüpfen. Die ausgereifte Technik kann dann im Anschluss für die Erarbeitung von Fragestellungen zur zelltypspezifischen Aufnahme verschiedener Zinksupplemente und der Inhibition der Aufnahme von Zink durch beispielsweise Medikamente verwendet werden. Auch soll getestet werden, ob eine organell-spezifische Ansammlung verschiedener Zinkpräparate stattfindet.

Epigenetische Regulation der Expression von Matrix-Metalloproteasen und Calprotectin, sowie der Einfluss von Zink auf ihre Expression

Matrix-Metalloproteasen (MMP) sind eine Gruppe von mehr als 20 zinkbindenden Endopeptidasen. Sie besitzen hohe proteolytische Aktivität und sind vor allem für den Abbau der Proteinbausteine der extrazellulären Matrix verantwortlich. Insbesondere MMP-1, -2, -8, -9 und -13 sind essentiell für die Funktionalität des Immunsystems und an der Entstehung bzw. am Abklingen einer Entzündungsreaktion, sowie der Wundheilung beteiligt.

Auch Calprotectin spielt während Entzündungsreaktionen eine zentrale Rolle. Das Molekül besteht aus zwei Untereinheiten und wird vor allem von Zellen der myeloischen Reihe gebildet. Seine Affinität zu zweiwertigen Ionen wie Zink und Mangan ist hoch, so dass diese essentiellen Spurenelemente den Pathogenen zu ihrer Abwehr entzogen werden können.

Deregulationen von Calprotectin und MMPs gehören zu den Markern entzündlicher Erkrankungen. Für beide ist der Einfluss von Zink auf ihre Aktivität beschrieben. Ob auch ihre Expression durch Veränderungen in der Zinkhomeostase verändert wird ist jedoch fraglich, obwohl es bereits Hinweise aus der Literatur gibt. Dass die Expression dieser Faktoren unter anderem durch epigenetische Veränderungen reguliert wird, ist ebenfalls publiziert. Da auch Zink epigenetisch aktiv ist, bestärkt dies die Vermutung, dass Veränderungen in der Zinkhomeostase sich auf die Expression von MMPs und Calprotectin durch myeloische Zellen auswirkt; eine Hypothese, die es zu untersuchen gilt. Da auch die Rolle epigenetischer Mechanismen in der Regulation der angegebenen Gene noch nicht umfassend geklärt ist, werden des Weiteren grundlegende epigenetische Untersuchungen in das Projekt mit einbezogen.  

Etablierung eines humanen Co-Kulturmodells zur Untersuchung in vitro

Zink ist für eine effiziente Immunantwort essentiell. Bei Patienten mit verschiedensten Entzündungserkrankungen wie akutem Lungenschaden (ALI) und Sepsis, wurde eine gestörte Zinkhomeostase gefunden. Extrem niedrige Serumzinkwerte konnten sogar mit einer schlechten Prognose und erhöhter Sterbewahrscheinlichkeit assoziiert werden.

Zink wird während einer physiologischen Entzündung im Rahmen der Akutphasereaktion in die Lunge transportiert, so dass es kurzzeitig zu einer Serumhypozinkemie kommt. Es wird vermutet, dass dieser kurze, aber deutliche Abfall des Zinkgehaltes im Serum ein „Gefahren-signal“ für das Immunsystem ist und zur Aktivierung der Zellen führt. Der Serumzinkgehalt normalisiert sich dann und auch die Entzündungsreaktion geht zurück bzw. anti-entzündliche und Wundheilungsprozesse werden aktiviert. Ob beim Übergang von entzündlicher zu anti-entzündlicher/regenerierender Phase Zink eine Rolle spielt, ist noch nicht geklärt.

Während überschießenden Entzündungsreaktionen, die zu Gewebeschaden führen, wurde ein langanhaltend erniedrigter Serumzinkgehalt gemessen. Ein existierender Zinkmangel wurde außerdem mit einer erhöhten Anfälligkeit für Entzündungserkrankungen in Zusammenhang gebracht. Daraus folgte die Hypothese, dass sich eine Zinksupplementation gegebenenfalls positive auf den Krankheitsverlauf auswirken und zu einer milderen Entzündungsreaktion führen könnte. Diese wurde für die Sepsis bestätigt und publiziert (Wessels & Cousins, 2015) und konnte kürzlich auch im Modell des akuten Lungenschadens nachgewiesen werden. Hier erklärte sich der geringere Gewebeschaden vor allem durch die erniedrigte Rekrutierung von Neutrophilen ins Gewebe und ihre schwächere Aktivierung. Da die Ergebnisse aus der Maus stammen, soll der Nutzen von Zink auch für das humane System überprüft werden. Hierzu wird ein in vitro Gewebemodell entwickelt, in dem auch die Interaktion von Immunzellen im Blut, mit den Gewebezellen in beispielsweise der Lunge näher betrachtet werden kann. Das Modell ist in der untenstehenden Abbildung illustriert.


Auf der basalen Seite eines Transwelleinsatzes werden Gewebezellen wie z.B. NCIH441 (Lungenzellen) ausgesät. Auf der apikalen Seite wachsen vaskuläre Zellen wie HUVEC (human umbilical vein endothelial cells). Das apikale Kompartiment kann zusätzlich mit primären, human Leukozyten gefüllt werden, um die Wechsel-wirkung mit Gefäß- und Gewebezellen zu analysieren. Basal können zu testende chemotaktische oder entzündungsfördernde Substanzen zugegeben werden, um auch die Rekrutierung von Immunzellen in das Gewebe zu analysieren.

Literatur:
Wessels, Inga; Cousins, Robert J. (2015): Zinc dyshomeostasis during polymicrobial sepsis in mice involves zinc transporter Zip14 and can be overcome by zinc supplementation. In American journal of physiology.
Gastrointestinal and liver physiology 309 (9), G768-78. DOI: 10.1152/ajpgi.00179.2015.

Grommes, Jochen; Soehnlein, Oliver (2011): Contribution of neutrophils to acute lung injury. In Molecular medicine (Cambridge, Mass.) 17 (3-4), pp. 293–307. DOI: 10.2119/molmed.2010.00138.

Zink hat einen maßgeblichen Einfluss auf die Funktion des Immunsystems und ist in dieser Hinsicht bereits Gegenstand vieler Studien gewesen, in denen zelltypspezifische Zinkeffekte beobachtet werden konnten. Im zinkdefizienten Milieu beispielsweise scheinen Entwicklung und Aktivierung myeloider Zellen auf Kosten der lymphozytären Proliferation priorisiert zu werden. In T-Zellen konnten diese Veränderungen auf das durch Zink beeinflusste IL-2-Signaling zurückgeführt werden. In myeloiden Zellen hingegen ist die Bedeutung der zellulären Zinkhomöostase für Zellentwicklung und –differenzierung bisher noch nicht hinreichend untersucht.

Für die Initiation von Monopoese und Granulopoese sind verschiedene „kolonie-stimulierende Faktoren (CSF)“ entscheidend. Hierzu gehören der Granulozyten-Macrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF), der G-CSF und der M-CSF. In Anbetracht der strukturellen Ähnlichkeit der Rezeptoren dieser Wachstumsfaktoren mit denen der Interleukin-Rezeptor-Familie, sowie der assoziierten Signalmoleküle könnte eine Veränderte Zinkhomeostase auch CSF-gesteuerte Signalwege beeinflussen. Daher wird der Einfluss von Zink auf das Signaling der drei verschiedenen CSFs in Zellmodellen untersucht. Erste Ergebnisse zeigen für die Untersuchung der GM-CSF-induzierten Signalwege, dass Zink die STAT5- und cRaf-Phosphorylierung beeinflusst (Aster et al. 2019). Da die bekannten Einflüsse von Zink auf das intrazelluläre Signaling keine Erklärung für unsere Beobachtungen lieferte, wurde eine zinkbasierte Veränderung der Membranfluidität in Betracht gezogen, die in dieser Form bisher noch nicht beschrieben worden war. Die Membranfluidität wird durch die Zusammensetzung der Membran, insbesondere dem Cholesterin- und Proteingehalt, beeinflusst. Die Fluidität beeinflusst die Ausbildung von Rezeptormultimeren und könnte so auch die Bildung des GM-CSF Rezeptorkomplexes und seine Funktion beeinflussen. Die Zugabe von Zink verringert die Expression von GM-CSR-Rezeptoren an der Zelloberfläche und veränderte die Fluidität der Membran. Zusammenfassend gehen wir davon aus, dass eine Inkubation mit Zink eine Veränderung der Membranfluidität hervorruft, die die korrekte Multimerisierung des GM-CSF-Rezeptors und damit die Signalweiterleitung über die assoziierten Moleküle unterbindet.
Untersuchungen der übrigen Rezeptoren und ihrer Signalwege in Zelllinien aber auch primären Zellen sind Inhalte des Projektes.

Referenzen
Aster, Isabell; Barth, Lisa-Marie; Rink, Lothar; Wessels, Inga (2019): Alterations in membrane fluidity are involved in inhibition of GM-CSF-induced signaling in myeloid cells by zinc. In: Journal of Trace Elements in Medicine and Biology 54, S. 214–220. DOI: 10.1016/j.jtemb.2019.04.018.