Third Generation Sequencing – Nanopore Sequenzierung

Die Sequenzierung von DNA/RNA mittels Nanoporen stellt eine von zwei kommerziell verfügbaren long-read single molecule Sequenziertechniken, auch als third-generation sequencing (TGS) bezeichnet, dar. Im Vergleich zum next-generation sequencing (NGS) (z. B. Illumina, sequencing by synthesis Methode), werden mit dieser Methode wesentlich größere Leselängen erreicht (siehe Review). TGS kommt ohne die sonst obligate Amplifikation der DNA aus und analysiert jedes einzelne DNA/RNA Molekül für sich. Dies biete große Vorteile bei der Analyse von Genomen und Transkriptomen. Zum einen können durch den Einsatz von nativer DNA/RNA Modifikationen, wie z. B. Methylierungen, ohne weitere chemische Umwandlung detektiert werden. Zum anderen bietet die enormen Leselänge mit bis zu zwei Millionen Basen die Möglichkeit uniforme Bereiche und strukturelle Veränderungen des Genoms vollständig zu erfassen. Mit TGS ist es zudem möglich, alle mRNA Moleküle in voller Länger zu analysieren und somit alle Spleißformen darzustellen.

Zur Analyse der Basenabfolge von DNA/RNA Molekülen werden diese bei der Nanopore-Sequenzierung von einem Enzym (Helicase) durch eine Proteinpore geführt, die sich in einer nicht leitfähigen Polymermembran befindet. Legt man nun eine Spannung über diese Membran an, so entsteht ein Ionenfluss durch die Pore, welcher abhängig von den Basen in der Pore verschieden groß ist. Somit lassen sich durch die Messung des Ionenstroms während der Translokation der DNA/RNA durch die Pore sowohl die Basenabfolge als auch etwaige Modifikationen der Basen messen.

Um eine Hochdurchsatzsequenzierung zu ermöglichen, stehen je nach Sequenzierer, pro flow cell 75 (Flongle), 512 (MinION/GridION) bzw. 3000 (PromethION) Poren zur parallelen Analyse von DNA/RNA Molekülen zur Verfügung. Dabei kann jede Pore mehrere zehntausend DNA/RNA Moleküle nacheinander sequenzieren, sodass je nach verwendeter flow cell bis zu einigen hundert Gigabasen an Sequenzinformation generiert werden können.

Die Gruppe Nanopore-Sequenzierung befasst sich hauptsächlich mit der Etablierung und Durchführungen verschiedener Sequenzieranwendungen. Hierbei liegt der Fokus darauf, Forschungsschwerpunkte des Institutes durch die neuen Möglichkeiten der Nanopore-Sequenzierung zu unterstützen, aber auch neue Methoden für die molekulargenetische Diagnostik zu etablieren. Zusätzlich unterstützen wir verschiedene Projekte an der Uniklinik RWTH Aachen, der RWTH und externer Arbeitsgruppen bei der Durchführung von Sequenzierprojekten.

Im Institut steht mit dem MinION, GridION und PromethION das gesamte Portfolio an Sequenziergeräten von Oxford Nanopore Technologies zur Verfügung und deckt somit alle Anwendungen und Skalierungen der Nanopore-Sequenzierung ab. Alle verfügbaren Kits für die Präparation von DNA- bzw. RNA-Libraries sind in der Arbeitsgruppe etabliert. Für die automatisierte Präparation von Sequenzier-Libraries kann zudem ein Mikrofluidik-Gerät, der Voltrax (ONT), und ein Biomek i5 (Beckman) genutzt werden. Die bioinformatische Analyse der Daten erfolgt zum größten Teil am Institut selbst, aber auch in Kooperation mit Prof. Ivan Costa (Institute for Computational Genomics, Uniklinik RWTH Aachen).
 

Publikationen:

Florian RT, Kraft F, Leitão E, Kaya S, Klebe S, Magnin E, van Rootselaar AF, Buratti J, Kühnel T, Schröder C, Giesselmann S, Tschernoster N, Altmueller J, Lamiral A, Keren B, Nava C, Bouteiller D, Forlani S, Jornea L, Kubica R, Ye T, Plassard D, Jost B, Meyer V, Deleuze JF, Delpu Y, Avarello MDM, Vijfhuizen LS, Rudolf G, Hirsch E, Kroes T, Reif PS, Rosenow F, Ganos C, Vidailhet M, Thivard L, Mathieu A, Bourgeron T, Kurth I, Rafehi H, Steenpass L, Horsthemke B; FAME consortium, LeGuern E, Klein KM, Labauge P, Bennett MF, Bahlo M, Gecz J, Corbett MA, Tijssen MAJ, van den Maagdenberg AMJM, Depienne C. Unstable TTTTA/TTTCA expansions in MARCH6 are associated with Familial Adult Myoclonic Epilepsy type 3. Nat Commun. 2019 Oct 29;10(1):4919. doi: 10.1038/s41467-019-12763-9.

Kraft F, Kurth I (2019) Long-read sequencing in human genetics. Med Genet. doi: 10.1007/s11825-019-0249-z

Kraft F, Wesseler K, Begemann M, Kurth I, Elbracht M, Eggermann T. Novel familial distal imprinting center 1 (11p15.5) deletion provides further insights in imprinting regulation. Clin Epigenetics 2019 Feb 15;11(1):30

Karsai G, Kraft F, Haag N, Korenke GC, Hänisch B, Othman A, Suriyanarayanan S, Steiner R, Knopp C, Mull M, Bergmann M, Schröder JM, Weis J, Elbracht M, Begemann M, Hornemann T, Kurth I. DEGS1-associated aberrant sphingolipid metabolism impairs nervous system function in humans. J Clin Invest. 2019 Jan 8. pii: 124159. doi: 10.1172/JCI124159

Elbracht M, Kraft F, Begemann M, Holschbach P, Mull M, Kabat IM, Müller B, Häusler M, Kurth I, Hehr U. Familial NEDD4L variant in periventricular nodular heterotopia and in a fetus with hypokinesia and flexion contractures. Mol Genet Genomic Med. 2018 Nov;6(6):1255-1260. doi: 10.1002/mgg3.490. Epub 2018 Nov 4
 

Ansprechpartner:

Dr. rer. nat. Florian Kraft
Tel.: 0241 80-80723
fkraftukaachende

Univ.-Prof. Dr. med. Ingo Kurth
Tel.: 0241 80-80179
ikurthukaachende

Dr. rer. nat. Matthias Begemann
Tel.: 0241 80-80036
mbegemannukaachende

Sebastian Gießelmann
Tel.: 0241 80-80723
sgiesselmannukaachende